故事从一个奴隶主与一个奴隶贩子的讨价还价中开始。

美国肯塔基州的奴隶主谢尔比在股票市场上投机失败，为了还债，决定把两个奴隶卖掉。一个是汤姆，他是在谢尔比的种植场出生的，童年时就当伺候主人的小家权，颇得主人欢心，成年后当上了家奴总管，忠心耿耿，全身心维护主人利益。另一个要卖掉的奴隶是黑白混血种女奴伊丽莎的儿子哈利，伊丽莎不是一个俯首贴耳死心塌地听主人摆布的奴隶，当她偶然听到主人要卖掉汤姆和自己的儿子哈利后，就连夜带着儿子在奴隶贩子的追捕下跳下浮冰密布的俄亥俄河，逃到自由州，再往加拿大逃奔。她丈夫乔治·哈里斯是附近种植场地奴隶，也伺机逃跑，与妻子汇合，带着孩子，历经艰险，终于在废奴派组织的帮助下，成功地抵达加拿大。

汤姆却是另一种遭遇。他知道并支持伊丽莎逃走，但是他自己没有逃跑。由于他从小就被奴隶主灌输敬畏上帝、逆来顺受、忠顺于主人这类的基督教说教，对主人要卖他抵债，也没有怨言，甘愿听从主人摆布。他被转卖到新奥尔良，成了奴隶贩子海利的奴隶。在一次溺水事故中，汤姆救了一个奴隶主的小女儿伊娃的命，孩子的父亲圣·克莱从海利手中将汤姆买过来。当了家仆，为主人家赶马车。汤姆和小女孩建立了感情。不久小女孩突然病死，圣·克莱根据小女儿生前愿望，决定将汤姆和其他黑奴解放。可是当还没有来得及办妥解放的法律手续时，圣·克莱在一次意外事故中被人杀死。圣·克莱的妻子没有解放汤姆和其他黑奴，而是将他们送到黑奴拍卖市场。从此，汤姆落到了一个极端凶残的“红河”种植场奴隶主莱格利手中。莱格利把黑奴当作“会说话的牲口”，任意鞭打，横加私刑。汤姆忍受着这非人的折磨，仍然没有想到要为自己找一条生路，而是默默地奉行着做一个正直人的原则。这个种植场的两个女奴为了求生，决定逃跑，她们躲藏起来。莱格利怀疑汤姆帮助她们逃走，把汤姆捆绑起来，鞭打得皮开肉绽，死去活来。但是汤姆最后表现出了他对奴隶主的反抗，什么都没有说。在汤姆奄奄一息的时候，他过去的主人、第一次卖掉他的奴隶主谢尔比的儿子乔治·谢尔比赶来赎买汤姆，因为汤姆是小谢尔比儿时的仆人和玩伴，但是汤姆已经无法领受他过去的小主人的迟来的援手，遍体鳞伤地离开了人世。乔治·谢尔比狠狠地一拳把莱格利打翻在地。

就地埋葬了汤姆。回到家乡肯塔基后，小谢尔比就以汤姆大叔的名义解放了他名下的所有黑奴，并对他们说：“你们每次看见汤姆大叔的小屋，就应该联想起你们的自由。”

《汤姆叔叔的小屋》既描写了不同表现和性格的黑奴，也描写了不同类型的奴隶主嘴脸。它着力刻画了接受奴隶主灌输的基督教精神、逆来顺受型的黑奴汤姆；也塑造了不甘心让奴隶主决定自己生死的具有反抗精神的黑奴，如伊丽莎和她的丈夫乔治·哈里斯。同时，也揭示了各种类型的奴隶主的内心世界和奴隶主不完全相同的表现。这本书通过对汤姆和乔治·哈里斯夫妇这两种不同性格黑奴的描述，告诉读者：逆来顺受、听从奴隶主摆布的汤姆难逃死亡的命运，而敢于反抗敢于斗争的乔治夫妇得到了新生。因此，《汤姆叔叔的小屋》对社会发展起到了积极作用，特别是对美国废奴运动和美国内战中以林肯为代表的正义一方获得胜利，产生了巨大的作用。作为一本文学作品，美国著名诗人亨利·朗费罗说它是“文学史上最伟大的胜利”。